.

.

Engenharia genética aplicada à produção de AT

Sistema de Agrobacterium

Para obter uma planta transgénica é necessário: isolar um gene de interesse; escolher uma técnica para transformar células vegetais (através da introdução desse gene nestas) e seleccionar uma técnica para regenerar, a partir de uma célula transformada, uma planta inteira. Após esta última etapa obtém-se uma planta transgénica, já que esta contém, além dos genes naturais, um gene adicional proveniente de um outro organismo (planta, bactéria, animal…).

Depois de isolar o(s) gene(s) de interesse, para a obtenção de plantas transgénicas, é necessária a inserção do gene em células vegetais. A grande maioria das plantas transgénicas até agora produzidas foram obtidas pela utilização dos métodos abaixo explicitados.

Na Natureza, as células das plantas vivem muitas vezes em íntima associação com certas bactérias, o que pode ser um veículo favorável para a introdução de DNA clonado nas plantas.

A Agrobacterium tumefaciens é responsável pela formação de tumores (galls) num largo número de dicotiledóneas. Esta doença toma o nome de crown gall. Durante a infecção a bactéria transfere parte do seu DNA para a planta, DNA este que é integrado no genoma da hospedeira, causando a produção de tumores e mudanças associadas ao metabolismo da planta. O modo peculiar de actuação desta bactéria permite que esta seja usada como forma de construção de plantas (plant breeding).

Qualquer gene desejado, como por exemplo; genes insecticidas, ou genes que causam resistência a herbicidas, podem ser colocados no DNA bacteriano e, através deste, inseridos no genoma da planta. O uso desta técnica não só encurta o convencional processo de plant breeding, como também permite a incorporação de genes completamente novos nas culturas.

A A. Tumefaciens é uma bactéria gram negativa, que não produz esporos, dotada de mobilidade, estreitamente relacionada com a Rhizobium (a qual forma nódulos fixadores de azoto nas leguminosas). Estudos demonstraram que a maioria dos genes envolvidos na doença causada por esta bactéria não são originários dos seus cromossomas, mas de um grande plasmídeo denominado de Ti (= Tumor inducing = indutor tumoral), mais precisamente, num segmento de DNA do plasmídeo denominado de T-DNA (Transferred

DNA = DNA transferido).

A Agrobacterium tumefaciens encontra-se geralmente nas e à volta das superfícies das raízes numa região chamada de rizosfera – onde sobrevive, usando nutrientes que escapam dos tecidos radiculares. Porém, ela infecta as plantas apenas em locais onde estas estejam lesionadas.

Em condições naturais, as células desta bactéria são atraídas para os locais de lesão por quimiotaxia. Este fenómeno é parcialmente uma resposta à libertação de açúcares e outros componentes radiculares. Porém, estirpes que contêm o plasmídeo Ti respondem ainda mais fortemente porque reconhecem os componentes fenólicos dos locais lesionados com a acetosyringone. Deste modo, uma das funções do Ti plasmídeo é codificar receptores adicionais específicos para a quimiotaxia que estão inseridos na membrana bacteriana e que permitem à bactéria reconhecer os locais de lesão.

A acetosyringone desempenha um papel posterior no processo de infecção porque quando em concentrações mais elevadas que aquelas que activam a quimiotaxia, ela activa os genes vir (virulentos) no plasmídeo Ti. Estes genes coordenam o processo infeccioso, levando à produção de proteínas (permeases) que estão inseridas na membrana celular da bactéria para o “uptake” dos componentes (opinas) que irão produzir tumores e induzem a produção de uma endonuclease de restrição – que corta a parte do plasmídeo Ti denominada T-DNA. O T-DNA é libertado pela bactéria e entra nas células das plantas onde é integrado no genoma destas, que passa a expressar estes genes. O resto do plasmídeo fica na bactéria, sendo usado para outras funções. Quando integrados no genoma da planta, os genes no T-DNA codificam para: produção de citocininas (uma fibrohormona); produção de ácido indolacético e para a síntese e libertação de novos metabolitos da planta – as opinas e agrocinopinas.

As hormonas da planta perturbam o balanço normal do crescimento da célula, levando à produção de tumores e, consequentemente, de um ambiente rico em nutrientes para a bactéria. Através desta estratégia, a Agrobacterium transfere alguns dos seus genes para a planta com os seus plasmídeos Ti, que representam vectores naturais de transferência de material genético para plantas.

Aproveitando esta característica inerente a esta bactéria, seleccionam-se genes que são colocados no T-DNA do plasmídeo bacteriano (em laboratório) para que possam ser integrados nos cromossomas da planta aquando da transferência do T-DNA. A base desta técnica é a extracção do T-DNA da A. Tumefaciens e a sua integração no genoma da planta como parte natural do processo infeccioso protagonizado por esta bactéria. Assim, qualquer gene pode ser introduzido numa célula vegetal, usando-se esta “ferramenta natural”. Todavia, para aproveitar estas propriedades naturais para a transferência de genes de interesse em plantas é necessário eliminar as características indesejáveis do T-DNA, mantendo a sua capacidade de se integrar no genoma da planta hospedeira.

Como as partes essenciais do T-DNA são as suas pequenas border repeats (25 pb) e pelo menos uma delas é necessária para a transformação da planta, torna-se apenas crucial a remoção dos genes que codificam as hormonas das plantas e genes antibiótico-resistentes. A transformação das plantas requer: uma célula de Agrobacterium para agir como veículo de um plasmídeo transformante; um Ti plasmídeo com um gene Vir funcional para o reconhecimento dos sinais da planta e para a excisão do T-DNA e o T-DNA com as supressões e inserções génicas.

Transferência directa de genes

Neste caso, os genes são inseridos directamente na célula vegetal, sem intermédio da agrobactéria. Este tipo de transferência de genes é o método de escolha quando se trata de plantas monocotiledóneas como milho, trigo etc.

A transferência de genes é alcançada por um dos seguintes métodos:

Electroporação de protoplastos e de células vegetais

Nesta técnica, retira-se a parede celular das células vegetais, tornando-as mais permeáveis. (Estas células, desprovidas de parede celular, são designadas de protoplastos.). Posteriormente, os protoplastos são incubados em soluções que contêm os genes que irão ser transferidos, e, em seguida, um choque eléctrico de alta voltagem é aplicado por curtíssimo tempo. O choque causa uma alteração da membrana celular, promovendo a abertura temporária de poros o que permite a penetração e eventual integração dos genes de interesse no genoma do protoplasto. O mesmo princípio também pode ser aplicado para células vegetais, porém, a taxa de transformação é mais baixa.

Esta técnica, para a transformação de células ou tecidos vegetais e animais, foi introduzida no início da década de 80. Anteriormente chamado "balística" (porque é baseado no princípio das armas de fogo), este método consiste em fazer aderir moléculas de DNA sobre micropartículas de ouro ou tungsténio. Em seguida, com o auxílio de um aparelho de pressão, as micropartículas são projectadas a alta velocidade (com pólvora ou gás) contra um tecido alvo (que neste caso serão os tecidos vegetais). As partículas penetram na parede celular e são depositadas dentro da célula, resultando na transformação de células individuais pela incorporação, no genoma da planta, dos genes introduzidos pelas micropartículas. Para regenerar plantas, ou seja, obter plantas adultas, independentemente do método utilizado para a introdução do gene, as células transformadas são cultivadas in vitro, num meio contendo nutrientes e hormonas vegetais. Porém, como cada espécie de planta tem diferentes exigências hormonais, nutricionais e ambientais para a sua regeneração, esta etapa ainda é uma das dificuldades na criação de plantas transgénicas. Existem dois caminhos possíveis que as células podem seguir para originar as novas plantas: a embriogénese somática e a organogénese. Na embriogénese somática, a partir de uma célula que se multiplica, organiza-se uma estrutura semelhante ao embrião que existe na semente normal. Na organogénese, várias células diferentes dão origem aos órgãos da planta, ou seja, às folhas, ao caule e às raízes, sem passar por um estádio de embrião.

Vacinas

A vacinação é uma grande vantagem na erradicação de doenças infecciosas, quer nos seres humanos, quer nos animais. Nos últimos anos, têm sido feitos novos progressos para desenvolver melhores vacinas que actuem ao nível das mucosas através da utilização de plantas geneticamente modificadas.

Nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, a formulação de vacinas orais que induzem a protecção das superfícies mucosas (imunidade mucosal) constituem vacinas atractivas, na medida em que, muitos dos agentes patogénicos que entram no seu hospedeiro, o fazem através das superfícies mucosas que recobrem os sistemas digestivo, respiratório e urogenital. Assim sendo, a primeira defesa do organismo é uma série de membranas mucosas, localizadas nestas regiões, e o meio mais eficiente de protecção destas superfícies é através da imunização destas. As plantas transgénicas são veículos seguros e baratos para produzir e libertar na mucosa antigénios protectores, contrariamente às vacinas injectáveis, que em geral não estimulam a defesa mucosal. Contudo, a aplicação desta tecnologia é limitada pelas respostas pobres do sistema imunitário às não particularizadas subunidades das vacinas e muitos mais estudos são necessários, para desenvolver estratégias que permitam uma memória imunitária após uma vacinação oral e

uma tolerância imunitária no hospedeiro.

Uma vacina ideal deveria ser termoestável, fácil de administrar (oral), sem efeitos colaterais, potente e eficaz. Contudo, as vacinas injectáveis podem causar efeitos colaterais como febre e eritrema no local da aplicação e as vacinas de vírus atenuados podem causar problemas, por exemplo em crianças desnutridas. Desta forma, as vacinas comestíveis podem vir a ser uma alternativa perfeita, pois possuem vários dos atributos necessários à vacina ideal. A potência vacinal é um requisito a ser discutido no caso de qualquer vacina oral porque a digestão parcial no estômago, pode limitar a quantidade de antigénios necessária para desencadear a resposta imunitária. De maneira geral, as proteínas variam bastante em relação à estabilidade no meio gástrico. Normalmente, vírus de plantas têm grande estabilidade estrutural e multiplicam-se em grande número no seu hospedeiro. Estes vírus poderiam então ser utilizados como vectores para expressar genes codificados para epítopos antigénicos da maneira que se desejasse. Se, por outro lado, sistemas apropriados forem desenvolvidos a partir de plantas comestíveis expressando antigénios nos seus tecidos, estas vacinas, já naturalmente bioencapsuladas, poderão ser ingeridas com a libertação subsequente dos antigénios, à medida que o alimento começa a degradar-se no tracto gastrointestinal. O contacto com a extensa mucosa intestinal associada ao tecido linfático induzirá a imunidade humoral da mucosa seguida pela resposta de memória imunitária.

A comunidade científica vê com bons olhos e vários órgãos de saúde pública, como a NIH e a Unicef, já investem bastante dinheiro nesta área. Entretanto, várias questões ainda devem ser respondidas, e vários problemas precisam ser resolvidos, antes da liberalização em massa destas vacinas. Entre os obstáculos da aplicação desta técnica, está a escolha das plantas correctas, pois cada planta apresenta o seu próprio desafio. As batatas são ideais: propagam-se rapidamente e podem ser armazenadas por longos períodos. Contudo, devem ser ingeridas sem cozedura, o que não é uma prática comum. As folhas do tabaco não fazem parte da dieta de nenhuma população. As bananas não precisam de ser cozidas, mas as suas árvores levam anos para dar frutos, e estes são sazonais. Além disso, após colhidas as bananas apodrecem rapidamente. Por isso, mais plantas têm sido testadas, tal como a alface, cenouras, amendoins, trigo, milho, arroz e soja.

Outra questão, pode ser colocada acerca do consumo quotidiano de vacinas, que poderia causar um fenómeno conhecido como tolerância oral - o organismo pode simplesmente passar a desligar suas defesas contra estas proteínas, tornando-se susceptível ao ataque do agente patogénico real. Além disso, alguns cientistas advertem para o facto de que a mãe que come o alimento com vacina estaria indirectamente vacinando o seu filho, quer seja o feto, através da placenta, ou o bébé, pela amamentação.

Actualmente, estão a ser desenvolvidos estudos sobre a aplicação de vacinas baseadas em plantas transgénicas em várias doenças, nomeadamente para: a sida, as alergias, o vírus Papilloma e mesmo para o Antrax.

Em síntese, a previsão é que as vacinas comestíveis jamais serão desenvolvidas como alimentos de rotina, mas serão produzidos sob condições supervisionadas e como parte normal do programa de imunização. Tendo em conta o que foi escrito, é fascinante poder acompanhar o progresso da ciência: as soluções em qualquer tempo precisam de ser simples, não necessariamente fáceis.

1 | 2 | 3